DNA polimerasi HS hotstart Taq ad alta specificità con tampone di caricamento E kit per PCR dNTP

HS Hotstart Taq DNA polimerasi

Solo per uso di ricerca

Componenti  

Conservazione

Questo reagente deve essere conservato a - 30~15 °C.

Descrizione

La Taq DNA   polimerasi HS hotstart è una Taq  DNA polimerasi a caldo  prodotta miscelando l'anticorpo Taq con la Taq DNA polimerasi in proporzione ottimale. In base alle proprietà termostabili dell'anticorpo Taq, l'attività   della polimerasi  di DNA di Taq hotstart HS rimane strettamente chiusa a 55 °C , minimizzando l'amplificazione non specifica durante le fasi di miscelazione e riscaldamento del   sistema di reazione . Quando la reazione viene mantenuta al di sopra di 30 secondi a 95 °C , l'anticorpo Taq viene completamente inattivato e l'attività della polimerasi viene completamente rilasciata, garantendo la sensibilità e la specificità di amplificazione estremamente elevate del sistema PCR. L'attivazione   della Taq  DNA polimerasi HS hotstart  non è influenzata dal pH del tampone, dalla resistenza ionica o da altri fattori. È adatto per varie    reazioni PCR hot-start e qPCR  basate sulla Taq DNA polimerasi . Può essere usato per amplificare geni a bassa copia da templati complessi (genoma, cDNA) ed è la    Taq   DNA polimerasi preferita a caldo  per reagenti diagnostici molecolari   basati su PCR/qPCR . Il prodotto PCR ha 3'-d estremità A e può essere clonato a vettore T.

Definizione unità  

Utilizzando DNA di sperma di salmone attivato come stampo/primer, l'attività di ingerire 10 nmol nucleotidi totali come sostanze insolubili in acido entro 30 min a 74 °C  è definita come 1 unità di attività (U).

  Controllo qualità

Rivelazione della chiusura dell'attività : In    1 × di tampone Champagne Taq, la reazione è stata condotta a 65 °C  per 30 minuti, e l'attività rilasciata   è stata <  5%.

Rivelazione del rilascio  di attività : In    tampone Champagne Taq 1 ×, dopo riscaldamento a 95 °C  per 30 sec, e l'attività rilasciata   è >  95%.

Rivelazione del residuo di esonucleasi:   50 U di questa   polimerasi  e 50 pmol   di ssDNA   e substrato di dsDNA sono stati incubati a 37 °C  per 16 h, e le bande di DNA  non sono cambiate dopo LA PAGINA di denaturazione.

Rivelazione del residuo di endonucleasi:   50 U di questa   polimerasi  e 0.3   μg di DNA pBR322 sono stati incubati a 37 °C  per 4 ore, e le    bande di DNA dei plasmidi non sono state cambiate mediante  elettroforesi su gel di agarosio.

Rivelazione di residuo di RNasi:   50 U di questa   polimerasi  e 1   μg  di RNA di cellule 293 sono stati incubati a 37 °C  per 30 minuti, e le bande di RNA  sono state immutate mediante elettroforesi su gel di agarosio.

 Rilevamento di residui di DNA di E.coli: Il residuo di acido nucleico in   50 U   di questa   polimerasi  è stato rivelato mediante   TaqMan   qPCR specifico per gDNA di E. coli, ed il residuo del    genoma di E. coli è stato inferiore a 10 copie.

Rivelazione funzionale:   Nel    sistema PCR da 20 μl, come stampo è stato utilizzato cDNA corrispondente all'RNA totale di cellule HeLa da 1 pg-200 ng per amplificare 4 differenti loci genici.   Il gradiente di resa del prodotto PCR potrebbe essere rivelato mediante fluorescenza dopo 35 cicli.   Come minimo, i corrispondenti prodotti di amplificazione sono stati ottenuti da cDNA corrispondente all'RNA totale di cellule HeLa di 1 pg.

Protocollo

Sistema di reazione

a.   Per la maggior parte delle reazioni PCR, la concentrazione finale ottimale di Mg2 ⁺  è 1.5-2 mm.   Mg2 ⁺  con una concentrazione finale di 2 mm è stato incluso nel sistema. Se necessario, la concentrazione ottimale di Mg2 ⁺  può essere esplorata con MgCl2 25 mm  ad intervalli di 0.2-0.5 mm.

b.   La concentrazione ottimale di reazione di diversi modelli varia e la tabella seguente mostra la quantità raccomandata di    modelli di sistema di reazione da 50 μl.

c. La quantità di enzima può essere regolata tra 0.125 e 0.5   μl . In generale, l'aumento della quantità di enzima può aumentare la resa di amplificazione, ma può diminuire la specificità.

*   quando il contenuto di GC del frammento amplificato è   >   60% e non è possibile ottenere una normale amplificazione dopo aver ottimizzato le condizioni ,     si consiglia di ottimizzare la reazione PCR (DSBio n. P9041).

 Procedura di reazione

* la temperatura di ricottura deve essere regolata in base al valore TM del primer, che è generalmente impostato a 3-5 °C  inferiore al valore TM del primer.